Преимущественный ответ кроличьих антител на C

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 9156 (2023) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Антитела, полученные у кроликов, иммунизированных пептидами, использовались в биологических исследованиях на протяжении десятилетий. Несмотря на широкое внедрение этого подхода, иногда бывает трудно воздействовать на определенные белки по нескольким причинам. Одно соображение, которое было отмечено у мышей, заключается в том, что гуморальные реакции могут преимущественно нацеливаться на карбоксильный конец пептидной последовательности, который не присутствует в интактном белке. Чтобы пролить свет на частоту преимущественного ответа кроличьих антител на С-концы пептидных иммуногенов, мы представляем наш опыт получения кроличьих антител к человеческому NOTCH3. Всего было получено 23 антитела против 10 пептидных последовательностей человеческого NOTCH3. Было установлено, что более 70% (16 из 23) этих поликлональных антител отдают предпочтение С-концу: антитела, реагирующие на пептид NOTCH3, в основном нацелены на концевую свободную карбоксильную группу иммунизирующего пептида. Антитела, предпочитающие С-концевые эпитопы, слабо или вообще не реагировали с рекомбинантными целевыми последовательностями с удлинением С-конца, что элиминировало свободную карбоксильную группу из структуры иммуногена; более того, каждая из этих антисывороток не выявила реактивности антител к белкам, усеченным перед С-концом иммуногена. При иммуноцитохимическом применении этих антипептидных антител мы аналогичным образом обнаружили реактивность по отношению к рекомбинантным мишеням, которые лучше всего связываются с клетками, экспрессирующими свободный С-конец иммунизирующей последовательности. В совокупности наш опыт демонстрирует сильную склонность кроликов к образованию антител к С-концевым эпитопам пептидов, полученных из NOTCH3, что, по прогнозам, ограничивает их использование против нативного белка. Мы обсуждаем некоторые потенциальные подходы к преодолению этой предвзятости, которые могут повысить эффективность генерации антител в этой широко используемой экспериментальной парадигме.

Разработка и применение исследовательских антител были необходимы для изучения белков. Среди исследовательских антител антипептидные антисыворотки завоевали значительную популярность, во многом благодаря выяснению большого количества генетических последовательностей, кодирующих белок, и технологическим достижениям в синтезе пептидов. Эти достижения позволяют, как правило, без труда получать антисыворотки путем иммунизации животных без необходимости производства или очистки белков-мишеней1,2.

Несмотря на то, что иммунизация антипептидами в целом успешна, иногда она не приводит к образованию антител, полезных для обнаружения белков-мишеней1,3. Неудачи связывают с неспособностью пептидного антигена принять ту же конформацию, что и целевой белок4, сокрытием целевой последовательности в недоступных областях5 или посттрансляционной модификацией целевого белка, которая не отражается в пептидном иммуногене.

В предыдущем исследовании Лян и его коллеги6 отметили еще одну потенциальную причину невозможности создания пригодных для использования антипептидных антител: преимущественное нацеливание антител на карбоксильный конец (С-конец) иммунизирующих пептидов, которого нет в интактном белке. Они сообщили, что иммунизация мышей внутренним эпитопом C-CAM1 вызывала гуморальный ответ в основном на С-концевой конец иммунизирующего пептида; моноклональные антитела мышей реагировали на иммунизирующий пептид в зависимости от С-конца иммуногена, но эти антитела не связывались с интактным белком. Исследователи пришли к выводу, что моноклональным антителам мышиного происхождения необходим карбоксилатный фрагмент, присутствующий на С-конце, который устраняется пептидной связью, присутствующей в интактном белке.

В другом исследовании Эдвардс и его коллеги7 разработали успешный подход к созданию антител против бактериальных белков, основанный на иммунизации кроликов небольшими пептидами, соответствующими С-концам отдельных белков. Это исследование показало, что кролики способны генерировать эффективные ответы на С-концы пептидов и что антисыворотки, вырабатываемые к коротким иммуногенам, были удивительно специфичны. Относительная доля антител, которые предпочитали С-концы пептидных иммуногенов, была высокой для нескольких зарегистрированных антител, что оценивалось с помощью пептидной конкуренции в анализах ELISA.