Выявление протеоформ Corynebacterium glutamicum через верхнюю часть

Том 13 научных докладов, номер статьи: 2602 (2023) Цитировать эту статью

864 Доступа

Подробности о метриках

Corynebacteriumlutamicum — бактерия, широко используемая в промышленном производстве аминокислот, а также широкого спектра других биотехнологических продуктов. Настоящее исследование описывает характеристику протеоформ C. glutamicum и их посттрансляционных модификаций (ПТМ) с использованием протеомики сверху вниз. Несмотря на предыдущие доказательства роли ПТМ в регуляции метаболизма C. Glutamicum, это первый нисходящий анализ протеома этого организма. Мы идентифицировали 1125 протеоформ из 273 белков, при этом 60% белков имели хотя бы один массовый сдвиг, что указывает на наличие ПТМ, включая несколько ацетилированных, окисленных и формилированных протеоформ. Кроме того, были идентифицированы белки, имеющие отношение к производству аминокислот, секреции белков и окислительному стрессу, с массовыми сдвигами, что позволяет предположить наличие нехарактерных PTM и протеоформ, которые могут влиять на биотехнологически значимые процессы в этой промышленной рабочей лошадке. Например, мембранные белки mepB и SecG были идентифицированы как расщепленная и формилированная протеоформы соответственно. В центральном метаболизме OdhI был идентифицирован как две протеоформы с потенциальной биологической значимостью: расщепленная протеоформа и протеоформа с PTM, соответствующими сдвигу массы на 70 Да.

Бактерия Corynebacteriumlutamicum — это промышленная рабочая лошадка, способная производить широкий спектр биомолекул из большого пула субстратов1 и в настоящее время является лучшим вариантом для производства L-альфа-аминокислот2. Производство аминокислот представляет собой многомиллиардный рынок3, годовой объем производства которого составляет около 10 миллионов тонн во всем мире2, при этом объемы l-глутамата и L-лизина соответствуют 3,3 миллионам тонн/год и 2,2 миллиона тонн/год соответственно2. Помимо производства аминокислот, C.lutamicum также используется в других биотехнологических процессах, таких как производство гетерологичных белков4, органических кислот5, каротиноидов, изобутанола6, полимеров7, а в последнее время был исследован его потенциал в процессах биоремедиации8.

Недавние разработки в области протеомики продемонстрировали важность посттрансляционных модификаций (ПТМ) у нескольких видов бактерий9. У C. glutamicum важность PTM была исследована ранее, выявив решающий эффект фосфорилирования ингибитора оксоглутаратдегидрогеназы (OdhI) на выработку l-глутамата10,11. Совсем недавно масс-спектрометрическая протеомика C.lutamicum показала влияние условий продуцирования l-глутамата на сукцинилирование и ацетилирование метаболических белков C.lutamicum, включая OdhI12.

В настоящее время существует два основных подхода к протеомике, которые называются «снизу вверх» и «сверху вниз». Вкратце, при восходящем подходе белки расщепляются протеазой (обычно трипсином), а последующие пептиды анализируются с помощью масс-спектрометрии, тогда как при восходящем подходе белки исследуются в их интактных формах13. В результате переваривания протеазами информация из нескольких областей белка может быть потеряна при подходах «снизу вверх», включая PTM. Кроме того, в этом подходе идентичность белка определяется на основе идентификации пептидов, и это может вызвать неоднозначность в тех случаях, когда пептиды могут принадлежать более чем одному белку13. Напротив, нисходящий подход позволяет идентифицировать полную последовательность белков. Более того, анализ интактных форм белков позволяет идентифицировать протеоформы, определяемые как разные формы белков, происходящие из одного и того же гена14. Такие протеоформы могут быть получены путем замены аминокислотных остатков, протеолитического расщепления, альтернативного сплайсинга и нескольких типов PTM15. Более того, разные протеоформы одного и того же белка могут выполнять разные функции и влиять на биологические процессы организма16. Сила протеомики сверху вниз была применена к другим бактериям17. Например, была проведена нисходящая протеомика Escherichia coli и идентификация протеоформ18. Несмотря на доказательства значимости ПТМ в метаболизме C. Glutacumum, на сегодняшний день не опубликовано никаких протеомных исследований «сверху вниз». Здесь мы провели первый протеомный анализ C. glutamicum сверху вниз, используя подход, устойчивый к предшественникам, для идентификации и выявления PTM и протеоформ.

Pro or UnimodAC: 1145, Δm = −1.997892 Da, Met- > Glu) or didehydro (UnimodAC: 401, Δm = −2.015650 Da) in the modified region. Moreover, several PrSMs were identified with Δm of approx. 30 Da. Inspection of its spectra resulted in the confirmation of this mass shift, but it is more likely that it resulted from two PTMs, one of 14 Da and other of 16 Da (supplementary Fig. S6), possibly corresponding to methylation and oxidation, respectively. Furthermore, an isotopic envelope could be detected near this identified proteoform (Δm = 30 Da) with the intact mass of the −2 Da modification of HMADP (supplementary Fig. S6, precursor in blue)./p>